El equipo del Centro de Regulación Genómica (CRG) liderado por Eva Maria Novoa ha publicado recientemente una nueva metodología que permite, por primera vez, cuantificar tanto los niveles de ARN de transferencia (ARNt) como sus modificaciones de forma rápida y poco costosa. Esto abre una puerta a un posible y revolucionario test diagnóstico para el cáncer que podría, en menos de 3h y por menos de 50€, indicar quién tiene cáncer y qué tipo, a partir de una simple muestra de sangre.
Detección del cáncer: AND vs ARN
Hasta ahora, a parte de con pruebas de imagen u otras a nivel clínico, el cáncer se podía detectar a partir del ADN (secuenciando las mutaciones existentes) o del ARNm circulante en sangre, liberado a través de la rotura de las células tumorales. La secuenciación del ADN se hace de forma rutinaria desde hace décadas, con Illumina siendo la tecnología más utilizada. Pero eso “puede costar miles de euros por muestra”, explica Novoa.
La detección del ARN, en cambio, puede ser más informativa y económica. Los ARNs de las células tumorales también se liberan a la sangre, y los ARNt son, de hecho, las moléculas de ARN más abundantes. Además, a lo largo de los años se han acumulado suficientes evidencias de que las modificaciones del ARN están alteradas en muchas enfermedades, en particular en diferentes tipos de cáncer. Así que saber qué ARNs hay en la sangre, y con qué modificaciones, podría indicar presencia de células tumorales, así como de qué tipo de tejido provienen. Esta es la idea detrás de la investigación del grupo del CRG.
Los ARNt son las moléculas de ARN más abundantes y sus modificaciones están alteradas en muchas enfermedades, en particular en diferentes tipos de cáncer, convirtiéndolos en muy buenos biomarcadores del cáncer.
Modificaciones del ARN, el quid de la cuestión
Oxford Nanopore Technologies, una tecnología alternativa a Illumina, comenzó en 2017 a permitir secuenciar no tan solo ADN, sino ARN nativo. “Hasta entonces, para saber la cantidad de ARN con Illumina, tenías que hacer una transcripción reversa (pasar de ARN a ADN complementario), amplificar este ADNc y secuenciarlo. Pero un grave problema es que la transcripción reversa ‘borra’ las modificaciones del ARN… por tanto, solo podíamos saber su abundancia, pero no las modificaciones. Se pierde mucha información, información importante”, asegura Novoa.
Con Illumina también se pueden llegar a estudiar modificaciones del ARN, a través de anticuerpos específicos contra una modificación concreta cada vez, pero es de forma indirecta y predeterminada, y sin resolución a nivel de molécula. Y con los ARNs que contienen muchas modificaciones – como los ribosomales (ARNr) o los de transferencia (ARNt), que pueden tener unas 30 modificaciones por molécula de media – es casi imposible convertirlos en ADN para ser secuenciados por Illumina.
La llegada de la tecnología Nanopore hizo posible secuenciar no solo ADN sino los ARN con sus modificaciones, haciendo ‘una fotografía’ más detallada de la información genética de la célula.
En cambio, Nanopore permite hacer ‘una fotografía’ de los ARNs de la muestra tal cual, con sus modificaciones – y de todos a la vez. La tecnología consiste en un pequeño aparato que cabe en la mano, de unos 10cm de longitud, que contiene dentro unas membranas con nanoporos o canales por donde pasan las moléculas de ARN o ADN. Al atravesar los poros, alteran la corriente eléctrica que pasa por éstos y el aparato lee este cambio de corriente y deduce la secuencia y las modificaciones. Aún se necesita cierta preparación (“hay que añadir un adaptador a los ARNs para hacer que pasen por los nanoporos a una velocidad constante y más lenta, que permita su lectura”, puntualiza la investigadora), pero es bastante sencilla, y la cantidad de información obtenida es muy grande.
Los kits comerciales de Nanopore permiten secuenciar ARNm, y hace tiempo que se usan, porque la abundancia de los ARNm se puede utilizar como biomarcador de algunos cánceres. Pero los ARNm son poco abundantes y hay que secuenciar muchísimos de ellos para encontrar diferencias entre muestras con o sin cáncer. Los ARNs no codificantes (como los ARNt con los que trabajan en el grupo de Novoa), en cambio, son mucho más abundantes, y, por tanto, mucho más informativos y mejores biomarcadores, con más capacidad diagnóstica.
El grupo dirigido por Eva Novoa ha conseguido usar Nanopore para secuenciar los ARN de transferencia, que son los más informativos pero muy pequeños y difíciles de detectar.
Por eso, desde que surgieron los primeros kits de Nanopore, el laboratorio de Novoa y otros del mundo han estado haciendo adaptaciones de esta tecnología para permitir secuenciar otros tipos de ARN más allá de los ARNm. Un reto con los ARNts, pero, es que son unas moléculas muy cortas – y, por tanto, se perdían y no se secuenciaban bien con el Nanopore. “Lo que hemos conseguido ahora es secuenciar bien estos ARNts. Hemos demostrado que podemos capturar muchísimas moléculas, detectando las abundancias correctas y sus modificaciones diferenciales”, especifica la jefa de grupo. Lo han conseguido gracias a modificaciones en la preparación de las librerías de ARN, y también en el análisis informático, en el que usan algoritmos e inteligencia artificial para analizar las secuencias y hacer predicciones.
De prueba de concepto a diagnóstico clínico
Sin embargo, antes de utilizar esta secuenciación de ARNt para hacer diagnóstico a nivel clínico, hay que entender mejor qué modificaciones específicas están ligadas a qué tipo de cáncer. “Conocemos algunas, pero no se han analizado de forma exhaustiva, precisamente porque hasta ahora no se podían analizar estas modificaciones de forma ‘no dirigida’; todo el mundo miraba las 4-5 modificaciones que se conocían y eran más sencillas de analizar”, dice Novoa. Pero ahora pueden hacer esta ‘fotografía’, y este será el primer paso del grupo; estudiar y clasificar las modificaciones vinculadas a cada tipo de cáncer.
Para hacerlo, el grupo está ahora buscando muestras de pacientes – para empezar, de cáncer de mama y de colon – tanto en biobancos como en colaboración con médicos en hospitales. “Necesitamos muestras variadas, de diferentes tipos de cáncer, y bien estratificadas, para obtener el máximo de información”, afirma la investigadora.
Después habrá que optimizar la secuenciación del plasma, ya que hasta ahora sólo han hecho los estudios con líneas celulares.
Y finalmente tendrán que entrenar el modelo computacional, de manera que a medida que se vayan secuenciando los ARN, vaya haciendo predicciones. “Hasta dónde llegarán estas predicciones, no lo sabemos. Quizás sólo hasta decir si la muestra es de cáncer o no – aunque yo creo que casi seguro que también podrá detectar de qué tejido viene”, asegura la bióloga. “Quizás podría decir si es un cáncer metastásico o no. O si es resistente a un determinado tratamiento. O en qué estadio está… todo dependerá de la cantidad de información que tengamos para entrenar el modelo”.
El objetivo final sería utilizar esta tecnología para hacer cribajes y diagnóstico precoz porque, cuánto antes se detecte el cáncer, más probabilidad de supervivencia y menor coste para el sistema de salud.
El objetivo sería usar esta tecnología para hacer cribaje y diagnóstico precoz de muchos tipos de cáncer a la vez.
Además de ser un aparato pequeño y muy portátil – cosa que facilitaría su uso en lugares sin grandes infraestructuras, ya que tan solo necesita un buen ordenador y electricidad – la secuenciación de ARNs con la tecnología Nanopore permitiría hacer un cribaje de muchos cánceres a la vez. “Cuando hacemos una mamografía, por ejemplo, a parte de que tiene un coste, sólo estamos detectando cáncer de pecho. Pero al analizar una muestra de sangre con Nanopore, creemos que podremos ver indicios de cualquier cáncer. Después, obviamente, se deberían hacer otras pruebas para validar resultados, pero sería un gran primer paso”, concluye Novoa.
